A2.1 连接不成功。
1).引物设计错误。
※ 设计原则：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位点(根据实验需求保留或删除)+基因特异性引物。
2).载体与目标片段使用比例失调。
※ 载体与目的片段添加比例：推荐载体和外源插入片段的最佳摩尔比是n（载体）：n（插入片段）=1：2；推荐直接用片段长度来计算用量，无需算摩尔浓度，以4 kb长度的载体为例，使用量为20 ng/kb×4 kb=80 ng，低于2 kb的载体取最低使用量40 ng；以1 kb长度的插入片段为例，使用量为40 ng/kb×1 kb=40 ng，低于0.5 kb的外源插入片段取最低使用量20 ng。
3).载体与目的片段不纯。
※ 推荐对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。若为未纯化的DNA，加入总体积不超过反应体系体积1/5。
4).操作问题或试剂盒失效。建议同时做阳性对照实验。
※ 判断方法：
①若阳性对照有克隆并检测为阳性，则排除试剂盒问题。
②若阳性对照无克隆，可能是操作问题或试剂盒失效。A2.2 连接成功但无克隆。
1).感受态细胞效率低。建议用转化效率＞107 cfu/μg的感受态细胞。
※ 判断方法：可转化0.1ng质粒（如PUC19），观察克隆数，若生长大于1000个菌斑，则转化效率大于107 cfu/μg。
2).抗生素种类选错或浓度不适当。
※ 建议将未线性化空载体转化涂板。判断方法：若未长克隆，则可能是抗性种类错误或浓度过高。需检查质粒图谱确认抗性或确认最适浓度。